После закрытия Гродненского кафедрального Софийского собора (1921г.) богослужебная утварь и иконы переносятся в бывший гарнизонный Свято-Покровский собор, который с этого момента принимает наименование кафедрального.
Так на стенах Покровского собора появились полотна икон Христа Вседержителя, Пресвятой Богородицы, Иоанна Крестителя, Святой Троицы и иные.
В Покровский собор была перенесена также почитаемая гродненцами икона великомученика и целителя Пантелеимона, написанная некогда в Афонском Пантелеимоновом монастыре для Гродненского Софийского собора. Обустройством нового кафедрального собора занимался, предположительно, его первый настоятель - протоиерей Кирилл Зайц.
Протоиерей Кирилл Зайц
Покровский Собор в эти годы становится средоточием жизни православных жителей г. Гродно. Православное население массово возвращалось из вынужденного беженства и должно было заново устраивать свою жизнь в городе.
Епископ Владимир (Тихоницкий)
В первые годы польской власти Гродненскую епархию возглавлял епископ Владимир (Тихоницкий), его сменил епископ Алексей (Громадский), затем кафедру возглавил епископ Антоний (Марценко) и последним гродненским архиереем этого периода был Савва (Советов).
Епископ Алексей (Громадский)
Польские власти осуществляли сильное давление на православную иерархию и предпринимали настойчивые попытки полонизации Православной Церкви. Покровский собор был одним из центров сопротивления полонизаторским устремлениям польской власти.
Протоиерей Ананий Сагайдаковский
В середине 30-х годов ХХ века настоятель Свято-Покровского кафедрального собора протоиерей Ананий Сагайдаковский стал неофициальным руководителем и идейным вдохновителем движения неприятия православными верующими попыток введения польского языка в богослужение Православной Церкви.
30 сентября 1934 года Гродненский кафедральный собор посетил предстоятель Польской Православной Церкви митрополит Дионисий (Валединский). К этому дню множество крестных ходов из самых отдаленных храмов епархии прибыли на богослужение в Гродненский собор. Сам храм был художественно декорирован изнутри и украшен иллюминацией снаружи. Это событие стало настоящим торжеством для православных г. Гродно и всей Гродненской епархии.
Настоятель Собора о. Ананий Сагайдаковский прилагал немало усилий для украшения Собора. За годы его настоятельства были обновлены напрестольные пелены, священнические облачения, сооружены новые аналои, приобретен серебряный Потир с золочением. По его инициативе были собраны средства и отлит большой колокол для колокольни Свято-Покровского собора. Прихожане Свято-Покровского собора торжественно встречали новый колокол храма при въезде в город и к кафедральному собору шли Крестным ходом, что вызвало недовольство польских властей.
В 1935 году в притворе Никольского придела была оборудована часовня для почитаемой гродненцами Казанской иконы Божьей Матери и сооружен новый киот.
Протоиерей Ананий заботился и о духовном образовании общины Покровского собора. По четвергам были организованы беседы священнослужителей с прихожанами, пользовавшиеся огромной популярностью.
Знаменательным в истории Собора стал престольный праздник Покрова Пресвятой Богородицы в 1938 году, когда из Жировичской обители в Гродненский кафедральный собор был принесен чудотворный образ Жировичской Богоматери. Крестный ход со святыней возглавил архиепископ Волынский и Кременецкий Алексей (Громадский), возглавлявший ранее Гродненскую епархию.
Активная пастырская деятельность о. Анания Сагайдаковского, его борьба за права православных белорусов привели к тому, что в 1938 году он решением польских властей был выслан из города. Сотни благодарных прихожан пришли проводить его на перрон железнодорожного вокзала.
В 20-е и 30-е годы ХХ века в Гродно существовала традиция крестных ходов от Покровского собора к Неману на праздник Крещения Господня. Такие крестные ходы собирали до 10 тысяч человек.
В сентябре 1939 года началась Вторая Мировая война. Последний бой в городе между польскими и советскими войсками состоялся фактически у стен собора. Польские солдаты и офицеры заняли оборону в доме офицеров, который располагается напротив Собора. Несмотря на интенсивную перестрелку, здание храма сильно не пострадало. Лишь незначительно был поврежден фасад, окна и крыша здания.
Полтора года с сентября 1939 года по июнь 1941 года советская власть не успела серьезно заняться религиозным вопросом на занятых территориях. Но и в это непродолжительное время многие священники православной церкви были подвергнуты арестам, преследованиям, а подчас и расправам без суда. В управление Гродненской епархией вступил архиепископ Пантелеимон Рожновский.
Архиепископ Пантелеимон Рожновский
Настоятелем Гродненского Покровского собора был назначен протоиерей Георгий Боришкевич.